北京创域源科技有限公司

谢谢您使用Nano3D公司的产品。
BiOAssay™使用磁力悬浮技术来快速实现生成3D细胞培养物，不需要人工支架和矩阵。NanoshuttleTM-PL是无动物源性，基于聚赖氨酸的纳米组装，将磁性纳米颗粒混合到细胞中，以便在磁力场中结合到一起。NanoshuttleTM-PL必须保存在4摄氏度。

产品使用

BiOAssayTM只做研究使用，不能够对人或动物使用。

96孔生物测试所需要的装备和材料：

· 96孔Bio-AssemblerTM 生物测试装备：包括600μL NanoshuttleTM-PL 溶，96孔超低吸附细胞培养板(2个)

· 70%酒精

· PBS缓冲液（不含该镁离子）

· 0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液 或其它推荐的溶液

· 移液管

· 细胞(悬浮或单层)

· 细胞培养基(2D细胞培养中使用的培养基，如果不含血清，使用胰酶中和液来抑制胰蛋白酶)

· 倒置显微镜

培养球体培养物所需要的材料和设备

 

 图1  96孔设备

使用 Bio-AssemblerTM 96孔装备培养依附在表层细胞的说明：

概述：

600mL NanoshuttleTM-PL可以使1瓶T-75培养瓶的细胞达到80%汇合。（大概600万个细胞），一个球体包含50,000个细胞，可以培养120个球体培养物。被石蜡包埋的球体可能需要更多的细胞。24孔Bio-AssemblerTM每孔放置300μl培养基，达到最好效果。该款设备配合Corning（#3473）96孔超低吸附细胞培养板。

根据不同的细胞类型或实验目的，可以选择其它，如有需要请咨询我们。

1. 使用你实验室标准的程序，在T-25，T-75或T-150培养瓶中培养你所需要的细胞达到80%的汇合。按照如下使用NanoshuttleTM-PL培养细胞：

a）将NanoshuttleTM-PL 从冷冻箱里拿出，在房间内放置至少15分钟，达到室内温度。

b）将溶液瓶上下均匀摇晃至少十次。

C）将NanoshuttleTM-PL直接添加到培养基里：T-25添加200μl, T-75添加600μl，, T-150添加1200μl。

注意：添加悬浮液的容量可以根据不同类型的细胞减少。在形成球体前确定实验需要添加的容量。

注意：NanoshuttleTM-PL具有暗黑色，细胞在被NanoshuttleTM-PL处理后，显示该颜色。

 

图2 使用悬浮液培养后，细胞表面上会是暗黑色的纳米粒。如图是人体肺部纤维细胞

2.使用实验室标准的细胞培养孵化条件，在培养瓶里培养被处理过的细胞，至少需要5个小时或培养一整夜，使用你实验室标准的细胞培养孵化条件。整夜的孵化培养也可以。

3. 当孵化培养期结束，将胰蛋白酶/EDTA，PBS缓冲液，培养基放置在37摄氏度的水里，保温/解冻。

4. 用无菌移液管将培养基从培养瓶中吸出（包括多余的NanoshuttleTM-PL）。

5. 添加PBS缓冲液清洗细胞，轻轻摇晃培养瓶，清除遗留的培养基和多余的NanoshuttleTM-PL。  我们建议一瓶T-25添加2ml，T-75培养瓶添加5ml ,T-150添加10mlPBS缓冲液。

6.用移液管吸出PBS缓冲液。添加足够的胰蛋白酶/EDTA溶液来分离细胞，溶液要覆盖细胞层。一瓶T-25添加1ml，T-75培养瓶添加2ml ,T-150添加4ml胰蛋白酶/EDTA。假如你的实验室已经建立了该标准， 请使用你实验室的标准。胰蛋白酶/EDTA溶液。

7. 放置培养瓶在培养箱里大概3-5分钟，或者您规定的标准时间来分离细胞。在显微镜下观察细胞的分离。

8.等待细胞分离的时候，使用浓度70%的酒精清洁圆点磁力驱动器，擦拭驱动器。保证磁铁驱动无菌，不被污染。

9.从培养箱里拿出培养瓶，用倒置显微镜观察确保细胞完全从表层分离。过度暴露在胰蛋白酶/EDTA里将不利于细胞健康，所以尽快进行下一步。

10. 添加37度的血清或含有血清的培养基，来抑制或使胰蛋白酶/EDTA失效。添加的容量应当至少与胰蛋白酶/EDTA容量相同。假如细胞对血清非常敏感，可以选择使用胰蛋白酶中和溶液或立即离心细胞（100G至少离心5分钟）,并且吸出胰蛋白酶。

11.用血球计或Coulter计数器来计算细胞数量。离心细胞，使细胞重新悬浮，需要按照所需的培养基容量。（每个球体培养物需要150-200 μl）

注意：我们建议每个球体培养物包含50,000个细胞，但是数量可以减少。在培养细胞球体培养物时，减少细胞数量。

球体培养物打印：

12. 用无菌移液管吸出悬浮的细胞，分配150μL细胞悬液到96孔超低粘附培养板中。
 

 

       图3  把96孔培养板挡在球体磁铁驱动上，来形成打印球体培养物

13. 关闭培养板，将其放置在圆点磁铁驱动上来打印球体培养物。培养板的底部放在驱动上。（图3）

14.放置培养板在驱动上至少15分钟，让细胞被吸引和凝聚。细胞应该会在培养板底部形成一个明显的大的暗黑色球体。

注意：长时间的打印时间，虽然也可以，但也许是不必要的，因为磁铁驱动会迅速凝聚细胞。根据具体的细胞，来确定打印的的时间，以便移除驱动后，还可以保持球体结构。

   

图4 15分钟打印后，3T3 murine embryonic fibroblasts形成的球体。球体的黑色来自纳米粒的暗黑色。

15. 打印结束后，移除驱动，将培养板放置在培养箱中，使用相同的试验时间来培养。球体培养物可以被培养3周。假如必要，培养2-3天后，更换培养基。使用圆点驱动吸住球体，在移除溶液时，以便减少细胞流失。（图5）

3D细胞培养后的处理:

球体培养好之后，标准的组织处理技术可以被使用，例如细胞固定，免疫组化石蜡包埋，或用qRT-PCR做 RNA分离。 

以下细胞已经被24孔或96孔设备成功培养：

Cell lines

•Murine Endothelial 

•Murine Embryonic Fibroblasts, pre-adipocytes (3T3)

•Murine Adipocyte

•Murine Melanoma

•Murine Neural Stem Cells

•Rattus Norvegicus Hepatoma

•Human Astrocytes

•Human Glioblastoma Multiforme (GBM) LN 229

•Human Embryonic Kidney 293 (HEK 293)

•Rat Vascular Smooth Muscle (A10)

Primary cells

• Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (HPMEC) 

•Human Tracheal Smooth Muscle Cells (HTSMC)

•Human Small Airway Epithelial Cells (HSAEpiC)

•Human Pulmonary Fibroblasts (HPF)

•Human Mesenchymal Stem Cells (HMSC)

•Human Bone Marrow Endothelial Cells (HBMEC)

•Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

•Human Aortic Vascular Smooth Muscle (HASMC)

•Murine Chondrocytes